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1 长度15-40bp2 引物碱基尽可能随机分布（G+C约60%）3 引物内部链避免二级结构4 引物碱基序列不应与非扩增区域有同源性或少于连续8个的互补碱基5 引物的3‘端为关键碱基 以上是我们分子课的笔记 下边是生化笔记1 引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸2 引物与靶序列间的Tm值不应过低3 引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列4 两引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基5 引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%大体上差不多。。。看你做哪门课的作业或考题了。。。
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；
4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；
5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；
8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；
10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；
11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；
12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。
简并引物通俗的讲是不完全相同的引物序列的混合物。使用简并引物是为了增强引物的通用性，即不同DNA序列的目的基因都可以用这种引物进行PCR扩增。其定义是为了获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。设计原则是把代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列等比例混合。反之，如果为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。
首先要搞清楚测序原理，很多时候我们要测的序列是很长的，现在的测序手段不可能去测全长，因此要把长的序列打断，这个时候会有很多短序列，就需要设计接头把你想要的序列拉出来上机测序，这个接头有可能是随机的，要看你做什么测序。
① 引物长度一般引物长度为18~30碱基。② GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%③ 退火温度退火温度需要比解链温度低5℃④ 避免扩增模板的二级结构区域⑤ 与靶DNA的错配等等
发布时间：2024-01-02 02:28
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