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能否详细描述一下两条带的位置，另外你以什么作为template？cDNA？因为一般情况下引物二聚体的条带都是或多或少的存在的。如果是目的条带有两条，那么可能是引物出现了错配，也有可能是本身就有两种可能。回收测序即可。追问：两条带距离很近，一条很亮一条很暗，用的DNA基因组回答：基因组DNA的话有杂带几乎不可避免，因为错配可能很大，挺正常的。如果两条带距离很近、又基本符合你目的片段的大小的话，可以继续跑胶让它们分开一些，然后切胶回收，连接T载体，转化涂板，挑菌测序。挑对的就行了。
不是，根据你的质粒载体序列，如果你的质粒载体序列里面有M13序列就可以用，可以用的比如生工的PUCm-T载体.
当然可以阿 M13通用引物测序跟哪来的片段没关系的 只要你把那个片段倒入M13噬菌体载体就ok
这种现象我也出现过，我分析的可能是因为M13引物自身的特性，如果P长片段，很可能会非特异的与质粒基因组DNA结合或者与质粒结合而产生长度在2000bp左右的条带，会很难验证克隆是否成功。所以，建议用目的片段的特异引物进行PCR反应，或者直接送测序。
呵呵，我以前也遇到过类似情况，至今不知道原因。可能是平板上连接产物残留污染。
建议检测克隆的退火温度提高至60-62度，挑取菌体尽量不要沾上培养基尽量少。
做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F, M13R；M13F(-47), M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。如果是样品需要测序的话，由于接近引物的读出效果不好，如果克隆的位点接近CMS的两端，一般需要用M13F(-47), M13R(-48)来测序。
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发布时间：2024-01-21 08:47
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